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盐酸法舒地尔对脑缺血再灌注大鼠神经元形态和Caspase9 mRNA表

时间:2016-10-15 20:15来源:首席医学网 作者:陈晓春 刘星亮 点击:
作者:陈晓春 刘星亮    作者单位:075000 张家口,河北北方学院附属第一医院神经内科
 
【摘要】  目的 观察盐酸法舒地尔对脑缺血再灌注大鼠神经元损伤的保护作用。方法 建立脑缺血再灌注大鼠模型,采用Caspase9 mRNA原位杂交技术,DAB显色,光镜观察细胞浆呈棕黄色为阳性细胞。经图像分析阳性细胞的数量,观察盐酸法舒地尔对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元的保护作用。结果 盐酸法舒地尔治疗组与模型组比较,Caspase9 mRNA阳性细胞平均密度减小(模型组4.83±0.49,治疗组2.2±0.30),平均灰度值增大(模型组123±7,治疗组191±8),组间比较有明显差异(P<0.05)。结论 盐酸法舒地尔对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元有一定的保护作用。
 
【关键词】  脑缺血再灌注 盐酸法舒地尔 细胞凋亡 大鼠
 
盐酸法舒地尔(Fasudil)是一种新型的细胞内钙离子拮抗剂,能够双重抑制磷酸化,临床主要用于急性脑血管病的治疗。本实验采用Bannister等[1]的颈动脉血管引流法建立大鼠脑缺血再灌注动物模型,用Caspase9 mRNA原位杂交技术、DAB显色,光镜观察细胞浆呈棕黄色为阳性细胞。经图像分析阳性细胞的多少,观察盐酸法舒地尔对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元的保护作用。
 
    1  材料与方法
 
    1.1  材料  健康雄性Wistar大鼠36只,体质量200~240 g,购自中国医科院实验动物繁殖场,笼中混养,供标准日粮、清洁的自来水,日照时间12 h,室温(25±3)℃。盐酸法舒地尔(商品名川威)由天津红日医药有限公司生产。Caspase9 mRNA原位杂交检测试剂盒由武汉博士德公司生产。彩色图像分析仪(1.00版)由北京航天大学生产。光学显微镜(OLMPUS IX141型)、透射电镜(JEM100CX II)由日本生产。
 
    1.2  方法
 
    1.2.1  模型制备及分组: 大鼠观察4 d后随机分为对照组、模型组和盐酸法舒地尔治疗组,每组12只,禁食12 h用于实验。应用Bannister等[1]介绍的颈动脉血管引流法建立大鼠脑缺血再灌注动物模型,将大鼠固定于手术台上,颈部正中切口,暴露右侧颈总动脉、右侧颈外静脉,分离左侧颈总动脉。夹闭左侧颈总动脉,从右侧颈总动脉远心端放血引流至右侧颈外静脉内。全脑不全缺血90 min后,放开左侧颈总动脉夹,夹闭右侧AV引流管,即再灌注120 min后断头取脑。盐酸法舒地尔治疗组于再灌注时腹腔注射给药(10 mg/kg);模型组腹腔注射等量生理盐水;对照组仅手术暴露血管。
 
    1.2.2  标本采集和处理: 大鼠均断头取脑,在脑视交叉后和下丘脑后横断(冠状面)将脑分成前、中、后3部分,在前、中切面上,取1.5mm厚脑片用于光镜切片,取后部分皮质1  mm3的组织数小块制作超薄切片。光镜切片染色用尼氏染色和苏木素伊红染色。Caspase9 mRNA原位杂交具体操作按说明书进行。图像分析利用北京航天大学提供的灰度及密度分析软件,对原位杂交后切片进行计算机图像分析,所有切片均在同一放大倍数(×400)下分析,以胞质着色深度代表mRNA含量的变化,灰度值越小,说明其阳性物质多(即mRNA含量高),反之灰度值大则说明着色浅(mRNA含量低)。
 
    1.3  统计学方法  采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示,组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
 
    2  结  果
 
    2.1  光镜观察  (1)对照组:大脑顶叶皮质神经元核大而圆,核仁清晰,胞质嗜酸性;大脑皮质血管周围及神经元周围有狭窄明亮带,是由于石蜡切片制片时组织收缩造成的人工假像所致,大脑皮质血管周围及神经元周围明亮带的宽度分别为4.2±0.8,2.9±1.0。尼氏染色:皮质锥体细胞及星形细胞,核呈空泡状,核仁清晰,尼氏体呈蓝色斑块状,分布于胞质中。(2)模型组:皮质部分神经细胞核固缩。着色加深,甚至有些细胞核、细胞质界限不清;血管周围和神经元周围水肿带明显增宽,其水肿带宽度分别为10.6±2.4、5.8±2.8。尼氏染色:皮质神经元尼氏体减少。(3)盐酸法舒地尔治疗组:皮质神经元大部分结构清晰,受损神经元明显减少,血管周围及神经元周围水肿带宽度分别为4.6±0.6、3.4±1.2。对照组水肿带的宽度小于模型组、治疗组(P<0.01),治疗组小于模型组(P<0.05)。尼氏染色:大部分神经元尼氏体基本正常,少数神经元尼氏体着色较浅。
 
    2.2  电镜观察  (1)对照组:大脑皮质神经元胞核大、圆,核仁明显,神经元胞质有丰富内质网、核糖体和较多的线粒体、高尔基体等细胞器;海马区神经元胞核规整,胞质细胞器丰富;皮质内血管内皮细胞核完整,细胞器丰富,基膜清晰。(2)模型组:大脑皮质许多神经元核内异染色质增多,胞质水肿,细胞器明显减少;皮质内血管周围水肿,基膜变窄或结构模糊(图1见封3)。(3)盐酸法舒地尔治疗组:大脑皮质神经元胞核规整,胞质细胞器丰富;皮质内血管周围水肿带缩小(图2见封3)。
 
    2.3  神经元中Caspase9 mRNA表达的变化  (1)正常组:皮质神经Caspase9 mRNA表达弱,阳性神经元少,平均密度与平均灰度值为1.68±0.20、203±10。(2)模型组:皮质神经元Caspase9 mRNA阳性神经元多,着色深(图3见封3),平均密度与平均灰度值为4.83±0.49、123±7。(3)盐酸法舒地尔治疗组:皮质神经元Caspase9 mRNA阳性细胞减少,着色变浅(图4见封3),平均密度与平均灰度值为2.22±0.30、191±8。平均密度比较,对照组低于模型组、治疗组(P<0.05),治疗组低于模型组(P<0.05);平均灰度值比较,对照组高于模型组、治疗组(P<0.01),治疗组高于模型组(P<0.05)。
 
    3  讨  论
 
    脑缺血后继发的病理生理改变对脑细胞造成的损伤是脑缺血损伤的重要原因之一,一般认为:坏死与凋亡是受损脑细胞死亡的两大主要机制,当损伤达到一定程度时引起细胞坏死,而低程度的损伤则导致细胞凋亡[2]。凋亡与缺血半影区迟发性神经元死亡有关,是一个主动过程,有内在基因参与。有研究证实,脑缺血缺氧后神经元死亡是一种凋亡现象。动物实验已发现缺血性脑损害的早期就出现凋亡细胞。以皮质、海马、纹状体等部位为主,24 h最明显,并持续几天或几周。Li等[3]用大脑中动脉闭塞模型研究发现,闭塞10~20 min,纹状体及视前区的凋亡细胞数为10~20个。闭塞30~80 min凋亡细胞数量增加到30~60个,并扩展到大脑皮质的选择性神经元,闭塞90~120 min时凋亡细胞达70~200个,形成凋亡细胞群[4]。
 
    Caspase是一高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族,成熟的Caspase可裂解其自身的酶原和其他下游Caspase酶原,启动蛋白酶级联反应,对细胞凋亡的起始和执行起重要作用。已知Caspase参与的凋亡过程有3条通路传导死亡信号:“细胞外”通路涉及细胞表面死亡受体(如Fas/CD95或TNF受体),通过形成死亡—诱导信号复合体激活Caspase8,进而激活下游效应Caspase。“细胞内”通路是死亡刺激直接诱导Cytoc由线粒体内膜间隙释放入胞浆,在DATP/ATP存在的条件下,Cytoc与胞浆蛋白Apaf1结合,形成cytocADaf1复合物,以凋亡体的形式激活Caspase9。最近被确认的第3条凋亡途径涉及内质网钙离子稳态的破坏和Caspase12的激活。朱炬等[5]实验证实了激活的Caspase 3在参与Caspase9激活的反馈环路。正常脑组织Caspase9 mRNA的含量极低,用普通的原位染交方法几乎测不出。本实验采用原位杂交技术观察到模型组Caspase9 mRNA呈强阳性表达,表现为阳性细胞密度增加,着色深(灰度值下降),统计学分析平均灰度值减小;与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),说明Caspase9 mRNA在CIR中表达增强,促进神经细胞的凋亡。盐酸法舒地尔治疗组与模型组比较皮质神经元Caspase9 mRNA阳性细胞减少,着色变浅,说明盐酸法舒地尔通过干预促调亡基因Caspase9 mRNA表达而发挥治疗作用,并从细胞超微结构上得到验证。Ca2+作为许多细胞生命活动的第二信使,在细胞凋亡中的作用也倍受关注。脑缺血再灌注后,细胞质内钙超载,影响内质网对钙的摄取和释放,造成内质网的应激,内质网应激诱导Caspase12表达,同时也导致胞质的Caspase7转移到内质网表面。激活的Caspase12进一步激活Caspase3而引发细胞凋亡[6]。盐酸法舒地尔能够双重抑制磷酸化,可以同时作用于几个诱发脑血管痉挛的蛋白激酶的关键部位,包括:(1)肌球蛋白氢链激酶:为引起血管平滑肌收缩的最后共同通路;(2)蛋白激酶C:通过磷酸化使血管平滑肌收缩,同时使自由基增多;(3)Rho激酶:抑制肌浆蛋白磷酸激酶激活肌浆球蛋白氢链的去磷酸化过程,同时盐酸法舒地尔还可抑制其他缩血管物质,阻止Ca2+内流。并阻碍无Ca2+存在条件下由脱氢肾上腺素或前列腺素F2所引起的血管收缩反应[7,8]。总之盐酸法舒地尔通过抑制Ca2+内流,抑制细胞凋亡基因的表达,从而保护脑缺血再灌注神经细胞。
 
【参考文献】
1 Bannister CM,Sonia A.Ischemia and revascularization of the middle cerebral Lerritory of the rat brain by manipalation of the blood vessels in the neck[J].Surg Neurol,1984,21:351.
 
2 严志康,肖端,龚梅芳.活血通脉汤及大黄对大鼠缺血再灌注损伤表达的影响[J].湖北中医杂志,2008,30(3):89.
 
3 Li Y,Chopp M,Jiang N,et al.Indution of DNA fragmentation after 10 to 120 min of focal cerebral ischemia in rats[J].Stroke,1995,26:1 2521258.
 
4 韩英,刘楠,陈荣华,等.大鼠脑缺血再灌注损伤后的细胞凋亡与Bcl2、Bax的表达[J].中国临床神经科学,2006,14(1):1518.
 
5 朱炬,王纪佐.大鼠局灶性脑缺血后再灌注期Caspase9 mRNA及Apaf1 mRNA表达的动态变化[J].中国临床神经科学,2003,11(1):2326.
 
6 焦东亮,倪秀石,高艳,等.丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后caspase3表达的影响[J].中国临床神经科学,2007,15(1):1923.
 
7 马景鉴,杨树源,魏源,等.盐酸法舒地尔治疗蛛网膜下腔出血所致脑血管痉挛的临床期试验研究[J].中华神经外科杂志,2006,22(1):3640.
 
8 黄维惠.盐酸法舒地尔治疗急性缺血性脑血管病的临床疗效[J].中国全科医学,2007,10(5):415.
 
 
原文链接:http://journal.9med.net/html/qikan/yykxzh/ynbzz/2009383/lz/20090531093117850_478982.html
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